依據(jù)研究抗原的特性和其制備的方法，有些表位不易與抗體接近?？贵w所識(shí)別的同源表位空間封閉的zui常見(jiàn)原因是：①其他分子的存在，特別是已經(jīng)結(jié)合在抗原分子上的蛋白質(zhì)或核酸可競(jìng)爭(zhēng)性接近表位；②蛋白質(zhì)抗原的修飾，特別是由細(xì)胞調(diào)節(jié)控制的蛋白質(zhì)磷酸化；③如同在細(xì)胞或組織染色中發(fā)現(xiàn)的復(fù)合物中抗原定位問(wèn)題。

 

(一)多聚體相互作用

    一種類(lèi)型的封閉是由結(jié)合在抗原分子上的其他分子所引起的，這種情況是由于蛋白—蛋白分子間的相互作用。如果在研究中抗體識(shí)別的表位與相互作用的蛋白結(jié)合位點(diǎn)重疊，就檢測(cè)不到抗體—抗原間的相互結(jié)合。這可以作為一種方法來(lái)測(cè)定蛋白—蛋白分子間是否存在相互作用。這種表位競(jìng)爭(zhēng)幾乎在任何分子間相互作用中都可以發(fā)現(xiàn)，但zui常見(jiàn)的是相關(guān)大分子間的相互作用，例如蛋白質(zhì)或者核酸。多聚體相互作用是免疫染色、免疫沉淀和免疫親和純化中常見(jiàn)的問(wèn)題，但對(duì)免疫印跡來(lái)說(shuō)則不多見(jiàn)，因?yàn)樵摷夹g(shù)中在

抗體加入之前抗原已經(jīng)*變性。

在不同免疫化學(xué)技術(shù)中抗體達(dá)到易接近性

對(duì)特異的抗體—抗原來(lái)說(shuō)，多聚體相互作用是影響抗體識(shí)別表位的重要因素，所以通常情況下更換一個(gè)識(shí)別不同表位的抗體即可解決。如果缺乏有關(guān)不同抗體結(jié)合位點(diǎn)的準(zhǔn)確信息，簡(jiǎn)單的方法是用抗體進(jìn)行檢測(cè)。由于多克隆抗體通常在多個(gè)位點(diǎn)識(shí)別抗原，因此與抗原的結(jié)合占優(yōu)勢(shì)，故多抗在解決多聚體相互作用問(wèn)題時(shí)成為。解決這個(gè)問(wèn)題的第二種辦法是在加入抗體之前破壞多聚體的相互作用。絕大部分蛋白—DNA、蛋白-RNA以及蛋白—蛋白分子間的相互作用，可以通過(guò)加入400mmol／L或更高濃度的鹽就能破壞，同時(shí)也破壞了抗原的結(jié)構(gòu)，但絕大部分抗體對(duì)抗原仍保持活性。對(duì)于多聚體更強(qiáng)的相互作用，可采用更劇烈的條件來(lái)破壞抗原—競(jìng)爭(zhēng)物之間的關(guān)系。

 

(二)蛋白質(zhì)抗原翻譯后的修飾

    阻礙抗體與同源蛋白質(zhì)抗原結(jié)合的另一因素是翻譯后的修飾，這種情況以蛋白磷酸化zui為常見(jiàn)，它能封閉某些單抗與抗原結(jié)合。由于這是影響細(xì)胞或細(xì)胞群內(nèi)蛋白的亞單位，通常情況下這種抗原結(jié)構(gòu)的空間變化只會(huì)減少信號(hào)的強(qiáng)度。然而在某些情況下抗原可被*修飾，從而阻礙了抗體與相應(yīng)抗原的結(jié)合?？梢愿鼡Q抗體或用酶處理蛋白質(zhì)抗原除去修飾來(lái)解決這一問(wèn)題，例如在蛋白質(zhì)抗原磷酸化的情況下可用磷酸酶處理。

(三)定位

    抗體易接近性的第三類(lèi)問(wèn)題是由抗原定位引起，例如免疫染色。如果抗原被包埋在一個(gè)復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，或者由于一個(gè)障礙性的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從物理性狀上講抗體不易與抗原結(jié)合，這是細(xì)胞或組織染色中*的問(wèn)題。

    解決這類(lèi)問(wèn)題比較困難，需要分別對(duì)待，因?yàn)樵诿恳环N情況下阻礙抗體達(dá)到抗原的機(jī)制是不一樣的，均需要作為一個(gè)單獨(dú)的問(wèn)題來(lái)考慮。解決這些抗體易接近性的各種方法都涉及采用某些物理手段破壞干擾結(jié)構(gòu)。zui常用的兩種方法是部分蛋白溶解和微波處理。部分蛋白溶解是有目的地去除抑制結(jié)構(gòu)而使靶抗原不受影響，為使蛋白溶解更加有效，需要調(diào)節(jié)蛋白酶的用量及孵育時(shí)間。通過(guò)固定方法可以提供某些幫助，因?yàn)閺奈锢砩现v抗原的許多區(qū)域是通過(guò)交聯(lián)結(jié)合在鄰近結(jié)構(gòu)上的，所以即使發(fā)生某種抗原的蛋白溶解剪接，至少部分抗原仍連接在其他局部結(jié)構(gòu)上。雖然如此，只有在空間上達(dá)到易接近性才是一個(gè)有效的方法。

    達(dá)到易接近性的第二個(gè)常用辦法是用微波處理樣本，適當(dāng)?shù)赝ㄟ^(guò)細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分變性以達(dá)到目的。但需要仔細(xì)調(diào)節(jié)微波處理的時(shí)間和強(qiáng)度，以便使抗體達(dá)到易接近性，但又不破壞抗原或可識(shí)別的細(xì)胞形態(tài)學(xué)。